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标准物质
2009-09-28 阅读: 作者:admin 编辑:admin

标准物质概述:

        转基因产品的检测与管理是世界性重大科学技术问题之一,同时也是一个关乎政治、经济、贸易等多重领域的关键问题。目前,转基因产品检测技术已应用到我国农产品进出口检验中,为每年数百亿种产品出口提供了技术保证。但在实际检测中,也面临着一些困难,主要在于转基因产品种类繁多,缺少标准物质,混合样品检测难度大,既要明确转基因品系,做定性鉴定,又要进行定量检测,另外需要使用一些全新的技术、设备,并提供严格规范化的实验条件以确保检测结果的准确性。
         标准物质是具有足够稳定性和均一性,用来校准、对测量方法进行评价或为物质定值的物质,在分析测试各行业均得到广泛应用。标准物质要经特定而有效的技术程序验证,具有一种或数种特性数值,并确定其可溯源性和不确定度。标准物质的赋值是通过国际实验室验证后得到的。
         在医学药学领域,标准物质的应用越来越广泛。标准品是临床分子诊断标准化的前提,也就是说,临床检测的某一标本中特定标志物的量值,不管用什么方法测定,均可以通过统一的标准品得到相近的结果,其量值均可溯源至同一标准,从而具有可比性。
         对转基因生物检测领域,标准物质同样至关重要。标准物质用于建立检测方法、进行校准和方法验证。有证标准物质用于控制实验过程和方法,以保证分析测试数据的准确性、可靠性、可重复性和可比性。一般认为,应用可靠的标准物质是得到高质量分析测定数据的前提和保证,同时也是做出结论的基础。因此,对有证标准物质的质量要求很高。理想的标准物质应该得到国际的认可,并通过认证。根据OECD与ISO的规定,标准物质应用于环保、医疗保健等领域进行测定时,应确保其数值可以追溯到由国家测量标准机构所维持的基本测量单位。在对转基因作物及其加工产品进行转基因成分检测和量化中,不管采用何种检测策略,应用标准物质作为统一参照物都是必须的。

标准物质定义:

        按照“国际通用计量学基本术语”和“国际标准化组织指南30”,标准物质有如下定义:
●标准物质(Reference Material,RM):
         具有一种或多种足够均匀和很好确定了的特性值,用以校准设备,评价测量方法或给材料赋值的材料或物质。
●有证标准物质(Certified Reference Material,CRM):
         附有证书的标准物质,其一种或多种特性值用建立了溯源性的程序确定,使之可溯源到准确复现的用于表示该特性值的计量单位,而且每个标准值都附有给定置信水平的不确定度。
●基准标准物质(Primary Reference Material,PRM)
         国际计量委员会(CIPM)于1993年建立了物质量咨询委员会(CCQM),在1995年的物质量咨询委员会会议上提出如下定义:一种具有最高计量品质,用基准方法确定量值的标准物质。基准方法(Primary Method of Measurement,PMM)是指,具有最高计量品质的测量方法,它的操作可以完全地被描述和理解,其不确定度可以用SI单位表述,测量结果不依赖被测量的测量标准。(全浩韩永志主编,《标准物质及其应用技术(第2版)》,2003)
         对转基因生物(GMO)检测来说,需要三种类型的有证GMO标准品:DNA-CRM,大多数重要的转基因事件的基质-CRM,蛋白质-CRM。有证标准物质必须是稳定和不降解的。然而,还是常常碰到标准物质降解的问题。

标准物质的特性:


         标准物质是以特性量值的稳定性、均匀性和准确性为其主要特征的,这三个特性也是标准物质的基本要求。
稳定性: 是指标准物质在规定的时间和环境条件下,其特性量值保持在规定范围内的能力。影响稳定性的因素包括,光照、温度、湿度等物理因素;溶解、分解、化合等化学因素和细菌作用等生物因素;对液体物质,稳定性还表现在不产生沉淀、不发霉等。
均匀性: 是指物质的一种或几种特性具有相同组分或相同结构的状态。从实际上讲,当物质各部分之间的特性量值差异不能用实验方法检测出来时,可以确定该物质是均匀的。因此,物质的均匀性就包括物质本身的特性和所用计量方法的某些参数,如计量方法的精密度和试样大小等。通常标准物质证书中都会给出均匀性检测的最小取样量。
准确性: 是指标准物质具有准确计量的或严格定义的标准值。当用计量方法确定标准值时,标准值是被鉴定特性值之真值的最佳估计,标准值与真值的偏差不超过计量不确定度。

转基因植物检测标准物质的分类:

(1)标准阳性物质:

这是一类用原始植物材料制成的标准物质(Fluka,Switzerland),是纯合的转基因植物材料,在PCR检测过程中用作阳性对照和配置定量检测的标准品,用于对GMO混合水平进行量化和分析。在转基因定量PCR检测过程中,阳性标准品是必须的,因此阳性标准品的配置要求非常严格,必须经过多个实验室的实验验证方可应用于转基因定量PCR检测。位于比利时的欧盟联合研究中心下属的标准物质与测量研究所(Institute for Reference Materials and Measurements,IRMM)专业配置和提供用于转基因定量PCR检测的阳性标准品。现已配置并提供涉及14种转基因作物的CRMs系列标准品60多种(详见表1),这些标准品已经在市场上销售。但这类来源于农产品的标准物质,其制备、贮存和测定过程受很多因子影响,很难维持恒定的量,而且并非所有的作物转基因品系都存在标准阳性物质。

(2)质粒标准分子:

         标准分子的概念由日本科学家Kuribara等于2002年提出,它是指一种含有转基因检测目的外源基因和内标准基因的特异性片段的线性化重组质粒分子。经验证质粒标准分子在GMO鉴定检测中是很好的标准阳性物质替代物。质粒分子的优点主要是可以通过微生物进行大量培养,DNA易于扩增,所以可提供无限稳定量的标准物质,并且纯度较高;且操作容易,稳定性高,同一个标准分子可以同时包含多个外源目的基因,经济又高效。甚至有学者将质粒标准分子称为“金标准物质”。
         在转基因定量PCR检测过程中,标准分子根据分子量大小与植物基因组DNA分子换算,从而完成对转基因样品的定量分析,具体的换算见公式1。另外在利用标准分子进行定量分析时,必须考虑质粒DNA和基因组DNA在反应中的差异,这个可以通过校正系数(Coefficient Values, CVs)来校正。CVs可以通过公式2来计算。在获得CVs值后,通过公式3可以分析获得转基因检测样品的转基因含量。标准分子的出现是为了解决阳性品缺乏和阳性标准品配置的难题,目前这个概念已经为许多科学家所接受,广泛的应用到转基因PCR检测,尤其是定量PCR检测中。
         公式1:质粒拷贝数=质粒质量(g) / (质粒分子碱基数×324.5×2)×6.02×1023
         公式2:CVs=纯合转基因植物外源基因拷贝数/纯合转基因植物内源基因拷贝数
         公式3:转基因成分含量%=(样品外源基因拷贝数×100)/(样品内源基因拷贝数×CVs)
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